AW-12全自動清洗工作站使用報告（2）
1 實驗背景
蛋白質印跡法（免疫印跡試驗）即Western Blot。是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學等眾多學科領域中常用的一種檢測特異蛋白質表達水平的實驗方法，傳統手工方法操作時間久，結果穩定性差，為了解決這些問題，捷美自主研發了一款AW-12全自動清洗工作站，代替繁瑣、重復、枯燥的手工實驗過程，自動化實現制冷低溫儲存、封閉、孵育、洗膜、回收一抗和二抗的整套Western blot孵育流程。實驗結果表明，AW-12的顯影效果完全可以達到傳統手工得到的效果，而且比傳統手工結果更穩定。
2 實驗目的
比較AW-12全自動清洗工作站和傳統手工方法操作Western blot實驗得出的顯影效果，驗證儀器使用的可靠性及穩定性。
3 Western Blot
3.1 制膠
3.1.1 準備
先用試管刷蘸取洗潔精洗去玻璃板上污漬，用自來水將板上殘留的洗潔精沖洗干凈，再用蒸餾水沖洗；先將棉墊墊于配膠板上，玻璃板對齊后放入夾中卡緊，然后垂直卡在架子上，然后向其中加滿ddH2O靜置5min，不漏，倒掉ddH2O,傾斜制膠板晾干。
3.1.2 分離膠
按照表1配制8%分離膠，振蕩混勻后用1ml槍沿兩塊玻璃板間的一角緩慢加入下層膠，槍內膠不要一次性全部加完，注意不能有氣泡，加至綠框下緣平行。最后在板內加入無水乙醇，液封。室溫下等待30min，待下層膠完全凝固后，倒掉上面的無水乙醇，傾斜制膠板晾干。
3.1.3 濃縮膠
準備好梳子，按照表1配制濃縮膠振蕩混勻后用移液槍加至玻璃板上緣，注意不能產生氣泡。隨從一側緩慢插入梳子，室溫下等待30分鐘，待上層膠完全凝固。
3.2 點樣和電泳
3.2.1
取下配好的膠置于電泳槽內，從槽中間加入電泳緩沖液，中間倒滿沒過梳子，外面至相應刻度線即可。平行拔出梳子，用200ul移液槍吹孔，以保證孔內通暢。按照Marker 加2.5ul/孔，蛋白樣品加10ul/孔。
3.2.2
蓋上電泳槽蓋子（注意正負極），電泳起始電壓為70V，待其進入到分離膠后調整電壓至90V跑至底部結束。
3.3 轉膜
3.3.1
在SDS-PAGE即將完成時，制備轉膜液，準備好冰塊，先將轉膜液預制冷，剪取于凝膠大小相當的PVDF膜一張及四張濾紙，PVDF膜于甲醇中浸泡2min左右轉移至轉膜液中。濾紙及海綿浸泡于轉膜液中備用。
3.3.2
按照下面的順序將膜與濾紙放置在轉移裝置上：負極→黑色海綿→2張濾紙→凝膠→PVDF膜→2張濾
3.4 封閉和抗體孵育
3.4.1 傳統手工方法
3.4.1.1
封閉：準備（貯備）好一個干凈的孵育盒，轉膜完成后，將PVDF膜完全置于封閉液中（含5%脫脂牛奶的PBST），然后將孵育盒放置于水平脫色搖床上，轉速60，室溫封閉1h。
3.4.1.2
洗膜：用PBST（含1%的Tween-20）洗膜，轉速110，3次，5min/次。
3.4.1.3
一抗孵育：將PVDF膜根據所要目的條帶進行剪裁，然后將其加入稀釋了適當濃度的一抗（用2%BSA稀釋1:1000）中，放置在水平脫色搖床上，轉速60，將搖床放進4oC冷庫中孵育過夜。
3.4.1.4
洗膜：用PBST洗膜，轉速110，3次，10min/次。
3.4.1.5
二抗孵育：加入HRP標記的羊抗鼠和羊抗兔的二抗（5%脫脂牛奶稀釋比例1：5000），置于水平脫色搖床上，轉速60，室溫反應1h。
3.4.1.6
洗膜：用PBST洗膜，轉速110，3次，10min/次。
3.4.1.7
最后向孵育盒中加入PBST，將孵育盒放入4℃冰箱中，等待顯影。
3.4.2 AW-12全自動清洗工作站的方法
3.4.2.1
準備：
① 提前根據實驗需求準備好一抗、二抗試管，以及孵育盒，打開儀器開關，預制冷。
②根據所選擇孵育盒的規格準備抗體的量（參見表2），然后將一抗二抗抗體加入對應抗體管中，并將抗體管放進對應的抗體儲存位置，孵育盒放進孵育槽中，手動向孵育盒中加入5%脫脂牛奶（加液量參見表2）。
③準備足量ddH2O（洗針液）和PBST（清洗液）于相對應的桶中，及時倒掉廢液桶中的廢液，以免廢液溢出。
3.4.2.2
剪膜：轉膜完成后，將PVDF膜根據所要的目的條帶進行剪裁，并將其放入對應的孵育盒中，蓋上孵育盒蓋子。
3.4.2.3
程序設置：
根據孵育盒的選擇及所選擇的通道（1-12），在顯示屏上點擊選擇對應的通道和孵育盒的規格，儀器根據所選的孵育盒規格提供了默認參數（參見表2），如有需求可以更改參數。程序設置完成后，點擊屏幕上的“運行”，程序開始運行。
3.4.2.4
管路清洗：
程序運行結束后，孵育盒始終保持低溫狀態，手動取出抗體管回收抗體，然后進入管路清洗頁面點擊“管路清洗”，開始清洗管路。
3.4.2.5
后續直接顯影就可關機并把膜取出，若暫時不顯影可在運行結束后，讓儀器始終保持此狀態，孵育盒及抗體儲存位置始終保持低溫狀態。
3.5 顯影
將膜取出，置于暗盒中，將適量的ECL發光液（1：1混勻后）均勻地加到膜上，進行膠片曝光。壓片，并用顯影液和定影液進行手工洗片，待膠片風干后掃描記錄實驗結果。
4 實驗結果與分析
從上面顯影結果可以明顯看出，應用AW-12全自動清洗工作站可以獲得清晰、低背景的結果，其效果完全可以達到或優于傳統手工得到的效果，并且儀器可以節省手工操作所花費的時間。
5 客戶試用提供顯影結果圖
（發布于：2021-05-20）