Western blot常見問題分析（下）
Western blot（WB）是實驗室中常見且重要的一種分子生物學實驗方法
具體的實驗原理和實驗步驟在前幾期中已經做了詳細的介紹，實驗步驟大致分為：蛋白提取、蛋白定量、SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉、一抗孵育、清洗、二抗孵育、清洗、蛋白檢測。步驟復雜，耗時長，容易出現各種問題，尤其對于新手來說更是一個挑戰。為了讓大家能夠將這個實驗做到完美，本期就簡單向大家總結歸納了WB實驗中常見的一些問題，并給出了解決方案，目的是為了讓大家了解WB實驗中的注意點和規范操作的必要性，同時也是方便大家在出現問題后能夠及時分析出原因，調整實驗方案，得到預期結果。
我們將常見問題總結歸納為背景高、條帶形狀異常、非特異性條帶、沒有條帶或條帶弱4大類。
本期我們接著介紹非特異性條帶、沒有條帶或條帶弱這兩種常見問題。
一、非特異性條帶
| 原因分析 | 建議解決方案 |
| 一抗濃度過高 | 降低一抗稀釋濃度，減少非特異性條帶 |
| 一抗特異性不高 | 可更換抗體 |
| 蛋白樣本降解 | 提取蛋白時可加蛋白酶抑制劑，全程冰上操作 |
| 目的蛋白可能存在多個剪切體 | 查閱說明書和文獻進行參考 |
| 一抗不純，被其他抗體污染 | 重新配制新的一抗溶液 |
二、沒有條帶或條帶弱
| 原因分析 | 建議解決方案 |
| 一抗/二抗濃度低，時間短 | 增加抗體濃度，延長孵育時間 |
| 一抗/二抗不匹配 | 確定抗體的種屬性 |
| 蛋白樣本濃度低 | 增加樣本的上樣量 |
| 蛋白降解 | 重新制備樣品，增加陽性樣本對照 |
| 轉膜不充分，或轉時間久了 | 轉膜后染色看轉膜的效果，控制轉膜的時間和電流 |
| 轉膜正負極反了 | 轉膜時認真檢查裝置和轉膜夾放置的方向 |
| 過度洗膜 | 要控制洗膜時間，不宜過長 |
| 過度封閉 | 減少封閉時間，或更換封閉液 |
| 二抗標記的HRP失效 | 檢查是否使用含疊氮化鈉的試劑或容器 |
從上面的問題分析可以看出在實驗過程中會出現很多人為操作上的失誤，比如封閉時間、清洗時間、抗體孵育時間的控制；抗體孵育的溫度條件；保持膜的濕潤等。為了避免這些人為操作所導致實驗失敗的因素，可以通過使用我司研發的一款AW系列全自動清洗工作站，從封閉到顯色之前都可以在這臺設備中完成，即可以控制時間和溫度，也大大節約了人為參與的時間，降低人為誤差，提高實驗成功率。
（發布于：2022-04-20）